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ELISA检测中的OD值了解多少？
发布时间：2021-06-07 09:21:43
“OD值”这个概念想必做实验的各位小伙伴们都不陌生，从判断提取核酸的质量及浓度，到BCA蛋白定量进行蛋白定量，又或者是ELISA实验检测目的蛋白含量，这些常用的基础实验都需要检测样品的“OD值”，但是，“OD值”到底是个什么东西，我们在测量“OD值”的时候又有哪些需要注意的问题。
什么是“OD”值？
OD全称optical density，也就是光密度，也可以称为吸光度。吸光度指的是利用物质特有的吸收光谱，来鉴别物质或者测定物质的含量，也就是将一束特定波长的光通过被检测物，被检测物可以将光吸收掉一部分，通过吸光度计算被检测物的浓度。一般被检测物浓度越高，吸光度的值就会越高。实验中也是利用“OD值”和被检测物的浓度之间的关系来根据吸光度。
了解了“OD值”是什么之后，接下来我们再看看在不同的实验中测量“OD值”有哪些需要注意的。
最需要注意的就是测量时的光波长。上文在介绍“OD值”概念时提到，吸光度利用的是物质特有的吸收光谱，实际操作中我们需要注意的最关键的也是这一点，不同物质的吸收光谱不同，最大吸收峰的波长也不同，为了达到最好的测量效果，一般来讲，我们需要在待测物质的最大吸收波长处来检测其“OD值”。例如，核酸在260nm波长处光吸收最大，而蛋白和酚类物质则在280nm波长处光吸收最大；BCA法检测蛋白含量时，显色反应后，溶液由浅绿色变为紫色，此时在560nm处有最大光吸收值；TMB法显色的ELISA实验，在加入终止液后溶液由蓝色变为黄色，在450nm处有最大光吸收。
除了吸收波长，一些实验还需要设置校正波长，校正波长往往远离最大吸收波长，作为本底吸收，排除由于气泡、灰尘等其他系统误差造成的“OD值”偏差。根据测得的“OD值”，进行双波长校正，可以有效的减少系统误差造成的影响。
对于测量得到的待测样本“OD值”还需要进行换算才可以得到最终的浓度，有很多小伙伴往往在这一步出现错误，功亏一篑。需要注意的地方也比较简单，就是根据对应试剂盒的说明书，采用推荐的曲线拟合方式进行拟合，拟合后需要看一下拟合曲线的R2值，约接近1证明曲线拟合度越高，结果越可信。如果R2值较低，则需要检查是否出现标准品稀释问题或实验操作出现失误。拿艾迪抗的试剂盒来举例，BCA 蛋白定量试剂盒，此款试剂盒推荐的标曲拟合方式就是直线拟合，而ELISA试剂盒系列产品，则推荐用四参数拟合方式进行标曲拟合。选择错误的拟合方式，会影响曲线拟合度，R2值较低，回归计算的待测样品浓度也不准确。温馨提示：BCA蛋白定量实验以及ELISA实验的显色过程都是受反应时间及温度等条件影响的，需要根据实验情况及时终止实验进行读数，做实验时尽量不要走开哦~
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